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猪用生物制品及相关猪源原辅质料中

  非洲猪瘟病毒核酸检测要领

1  适用规模

1.1猪用及接纳猪源原辅质料制备的生物制品制品及半制品。。。。。。。

1.2猪源毒种。。。。。。。 

1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。。。。。。。

1.4其他猪源原辅质料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。。。。。。。

2  取样和处置惩罚

2.1 疫苗

2.1.1  活疫苗  取至少2瓶样品，，，，，，，按瓶签注明头份用相宜稀释液划分稀释成10头份/0.2ml，，，，，，，等量混淆，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.1.2  灭活疫苗  取至少2瓶样品，，，，，，，等量混淆后举行以下处置惩罚。。。。。。。

2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗  取36 ml混淆疫苗，，，，，，，加入正戊醇4.0 ml，，，，，，，充分振荡混淆1分钟，，，，，，，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，，，，，，，直至油相和水相疏散。。。。。。。取水相举行核酸提取。。。。。。。

2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗

2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗  取混淆疫苗5.0 ml，，，，，，，摇匀，，，，，，，加入0.25 g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），，，，，，，放入摇床（200 r/min）37℃解离1小时，，，，，，，5000 r/min离心10分钟，，，，，，，取上清液举行核酸提取。。。。。。。

2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗  直接取混淆样品举行核酸提取。。。。。。。

2.2 其他生物制品和半制品冻干类制品，，，，，，，按活疫苗举行取样和处置惩罚；；；；；液体制品及半制品，，，，，，，取至少2份（瓶）样品，，，，，，，等量混淆，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.3 猪源毒种  取至少2支毒种。。。。。。。冻干毒种，，，，，，，按冻干前体积复溶后等量混淆，，，，，，，取混淆液举行核酸提。。。。。。；；；；；非冻干毒种，，，，，，，等量混淆后直接取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.4 猪源细胞  除尚有划定外，，，，，，，取至少2瓶细胞浓度不少于10^7.0个细胞/ml的细胞悬液举行核酸提取。。。。。。。

2.5 其他猪源原辅质料

2.5.1 猪组织  每种组织，，，，，，，划分取样和处置惩罚。。。。。。。取不少于2.0 g组织，，，，，，，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，，，，，，，70℃灭活30分钟，，，，，，，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，，，，，，，取上清液举行核酸提取。。。。。。。

2.5.2 猪血清  每批血清取至少2个最小包装的样品，，，，，，，等量混淆，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.5.3 猪胰酶  干粉状胰酶，，，，，，，取至少2份样品，，，，，，，凭证使用情形划分派制成不低于2.5%浓度的溶液，，，，，，，等量混淆，，，，，，，取混淆液举行核酸提。。。。。。；；；；；液体胰酶，，，，，，，取至少2个最小包装的样品，，，，，，，等量混淆，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.5.4 其他猪源衍生物  固体、液体或干粉状猪源衍生物，，，，，，，可划分按组织、血清或干粉状胰酶的要领举行取样和样品处置惩罚。。。。。。。

3  核酸提取

3.1 试剂和器材

3.1.1 试剂  凭证核酸提取要领确定，，，，，，，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。。。。。。。

3.1.2 仪器  核酸含量测定仪；；；；；常温台式离心机；；；；；旋涡振荡器；；；；；水浴锅；；；；；微量移液器1套（最大宗程划分为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）。。。。。。。

3.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。。。。。。。

3.2  操作程序（TRIZOL法），，，，，，，也可以选择其他等效核酸提取要领提取样品中的DNA。。。。。。。

3.2.1 取样品250 ?l，，，，，，，加入750 ?l Trizol，，，，，，，倒置混匀，，，，，，，室温安排5分钟。。。。。。。

3.2.2 加入200 ?l氯仿，，，，，，，充分混匀，，，，，，，室温安排10 分钟，，，，，，，4℃下以12000 g离心15 分钟。。。。。。。

3.2.3 弃去上清液，，，，，，，加入220 ?l无水乙醇，，，，，，，倒置混淆，，，，，，，15～30℃安排2～3分钟，，，，，，，2～8℃以2000 g离心5分钟，，，，，，，沉淀物为DNA。。。。。。。

3.2.4 弃去上清液，，，，，，，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 ?l洗涤DNA，，，，，，，15～30℃安排30分钟，，，，，，，2～8℃以2000 g离心5分钟。。。。。。。重复一次。。。。。。。

3.2.5 加入75%乙醇1.2 ml，，，，，，，重悬DNA沉淀，，，，，，，15～30℃安排20分钟，，，，，，，4℃2000 g离心5分钟。。。。。。。浚？？？？芍馗匆淮，，，，，，，充分洗涤DNA沉淀。。。。。。。

3.2.6 弃去上清液，，，，，，，洞开离心管管口，，，，，，，在空气中干燥5～10分钟，，，，，，，加入30～50 μl的无核酸酶灭菌水消融DNA，，，，，，，－20℃以下生涯备用。。。。。。。

3.3  注重事项

3.3.1核酸提取试剂具有侵蚀和强变性能力，，，，，，，应做好小我私家防护，，，，，，，佩带手套、口罩和护目镜，，，，，，，避免液体飞溅到皮肤和眼睛。。。。。。。

3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，，，，，，，要避免样品之间相互污染，，，，，，，最好使用带滤芯的枪头，，，，，，，且每次吸收取液体时均需替换枪头。。。。。。。

3.3.3为避免核苷酸降解，，，，，，，应阻止核酸酶污染，，，，，，，使用的耗材均需无核酸酶。。。。。。。

3.3.4做好剩余样品的无害化处置惩罚及操作台面的消毒处置惩罚。。。。。。。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处置惩罚，，，，，，，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处置惩罚，，，，，，，操作台面使用1%卫可擦拭。。。。。。。

3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，，，，，，，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，，，，，，，避免污染。。。。。。。

4  检测

下列两种要领可任选其一。。。。。。。

4.1  实时荧光定量PCR检测法

4.1.1 试剂和器材

4.1.1.1 试剂

4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂  本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，，，，，，，也可选用其他荧光定量PCR试剂。。。。。。。

4.1.1.1.2 扩增引物及探针

扩增引物：

ASF-05-Zsak-1466F（10 ?mol/ L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R（10 ?mol/ L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探针ASF-05-Zsak-1486prob (10 ?mol/ L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3  无核酸酶的灭菌水  PCR级别。。。。。。。

4.1.1.2  仪器  荧光定量PCR仪；；；；；微量移液器1套（最大宗程划分为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）。。。。。。。

4.1.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。。。。。。。

4.1.2  操作程序

4.1.2.1 样品DNA制备  凭证前述要领举行核酸提取。。。。。。。

4.1.2.2 反应系统的配制  配制比样品数目至少多4个的反应系统，，，，，，，同时设置强阳性、弱阳性和阴性比照。。。。。。。在强阳性和弱阳性比照反应管中划分加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 ?l，，，，，，，在阴性比照反应管中加入3?l无核酸酶灭菌水。。。。。。。每个PCR反应管中应包括以下因素：

4.1.2.3  反应程序  将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性比照反应管放在荧光定量PCR仪中，，，，，，，凭证以下程序举行扩增：50℃2分钟，，，，，，，95℃5分钟，，，，，，，95℃15秒，，，，，，，58℃退火延伸1分钟，，，，，，，45个循环（荧光信号网络在此阶段每次循环的退火延伸时举行）。。。。。。。

4.1.2.4  效果判断

4.1.2.4.1  阈值设定  试验操作竣事后，，，，，，，确定Ct值。。。。。。。Ct值为每个样品反应管内荧光信号抵达设定阈值时所履历的循环数。。。。。。。

阈值设定原则：凭证仪器噪声情形举行调解，，，，，，，以阈值线恰恰凌驾阴性比照扩增曲线的最高点为准。。。。。。。

4.1.2.4.2  质控标准

比照组的检测效果应切合以下情形，，，，，，，此次检测方为有用：

阴性比照无Ct 值，，，，，，，且无扩增曲线。。。。。。。

强阳性比照的Ct 值应在18～22之间，，，，，，，并泛起典范的扩增曲线。。。。。。。弱阳性比照的Ct 值应在33～35之间，，，，，，，并泛起典范的扩增曲线。。。。。。。

4.1.2.4.3  判断

阴性：无Ct值，，，，，，，且未泛起扩增曲线，，，，，，，判断为样品中无ASFV核酸。。。。。。。

阳性：Ct值≤40，，，，，，，且泛起典范的扩增曲线，，，，，，，判断为样品中保存ASFV核酸。。。。。。。

可疑：Ct值>40，，，，，，，且泛起典范扩增曲线，，，，，，，判断为可疑，，，，，，，应重检。。。。。。。重检后，，，，，，，Ct值≤40且泛起典范扩增曲线者判为阳性，，，，，，，其他情形均判断为阴性。。。。。。。

4.2  通俗 PCR检测法

4.2.1  试剂和器材

4.2.1.1  试剂

4.2.1.1.1 PCR试剂  10×PCR缓冲液（含25 mmol/l  Mg²⁺），，，，，，，DNA扩增酶，，，，，，，dNTP预混液。。。。。。。

4.2.1.1.2扩增引物

primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；；；；；

primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。。。。。。。

4.2.1.1.3  DNA分子量标准品  DL500。。。。。。。

4.2.1.1.4  TAE电泳缓冲液  配制要领见《电泳液标准配制流程》。。。。。。。

4.2.1.1.5  1%琼脂糖凝胶板  在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，，，，，，，加热融化，，，，，，，加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，，，，，，，混匀，，，，，，，倒入水平安排的凝胶盘中，，，，，，，胶板厚度达5.0 mm左右。。。。。。。凭证样品数目选用相宜的梳子。。。。。。。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，，，，，，，放入电泳槽中，，，，，，，加1×TAE缓冲液淹没胶面。。。。。。。

4.2.1.2 仪器  DNA扩增仪，，，，，，，稳压稳流电泳仪，，，，，，，水平电泳槽，，，，，，，凝胶成相系统（或紫外透射仪），，，，，，，微量移液器1套。。。。。。。

4.2.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）。。。。。。。

4.2.2 操作程序

4.2.2.1 样品DNA制备  凭证前述要领举行核酸提取。。。。。。。

4.2.2.2 反应系统的配制  配制比样品数目至少多3个的反应系统，，，，，，，同时设立阳性和阴性比照。。。。。。。在阳性比照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 ?l，，，，，，，在阴性比照反应管中加入2.0 ?l无核酸酶灭菌水。。。。。。。每个PCR反应管中应包括以下因素：

4.2.2.3  反应程序  将所有待检样品及阳性和阴性比照反应管放在PCR仪中，，，，，，，凭证以下程序举行扩增：94℃2分钟，，，，，，，94℃30秒，，，，，，，60℃30秒，，，，，，，72℃30秒，，，，，，，35个循环；；；；；72℃10分钟。。。。。。。4℃生涯。。。。。。。

4.2.2.4  PCR扩增产品剖析  取PCR扩增产品10 ?l，，，，，，，加6×加样缓冲液2.0 ?l，，，，，，，混匀，，，，，，，用1.5%琼脂糖凝胶对混淆物举行电泳剖析，，，，，，，电压120V，，，，，，，电流50 mA，，，，，，，电泳时间30分钟。。。。。。。电泳竣事后，，，，，，，用凝胶成像系统照相，，，，，，，纪录检测效果。。。。。。。

4.2.2.5 效果判断

4.2.2.5.1 质控标准

比照组的检测效果应切合以下情形，，，，，，，此次检测方为有用：

阴性比照应不泛起257bp的特异性条带。。。。。。。

阳性比照应泛起257bp的特异性条带。。。。。。。

4.2.2.5.2 判断

阳性：待检样品泛起与阳性比照巨细一致的扩增条带，，，，，，，判断为非洲猪瘟病毒核酸阳性，，，，，，，扩增产品可通过DNA测序进一步确定基因型。。。。。。。

阴性：待检样品未泛起与阳性比照巨细一致的扩增条带，，，，，，，判断为非洲猪瘟病毒核酸阴性。。。。。。。

4.3  注重事项

4.3.1检测历程中应遵照PCR实验分区原则，，，，，，，即应区分试剂配制区、样本处置惩罚区、核酸扩增区。。。。。。。

4.3.2应阻止在含有靶序列的区域中使用引物，，，，，，，避免污染靶序列。。。。。。。